马传染性贫血病毒阿根廷流行毒株前病毒gag和gp90基因在马体内的变异分析

    摘　要:为建立美洲马传贫毒株和我国弱毒疫苗株鉴别诊断PCR,对接种马传贫阿根廷流行毒株后马4个发热期23、40、51和70 d)外周血单核细胞前病毒DNAgag基因和gp90基因的核苷酸序列进行了监测,经过序列分析发现4个发热期中前病毒gag基因核苷酸序列变化不明显,变异率在1%之内,表明前病毒gag基因在马体内比较保守,可以作为设计鉴别诊断引物的区域;gp90区的基因变化比较大,核苷酸序列变异率在8%~10%之间,通过对几个发热期核苷酸序列推导氨基酸的分析,可以划分出A1、A2、A3和A4 4个可变区,但其中A1和A4变异都很稳定,在马体发病的整个过程中均只发生1次变异,而A2区第3个发热期变异后,在第4个发热期又回复了突变。对马传染性贫血病毒阿根廷代表毒株前病毒gag和gp90基因核苷酸序列的动态检测结果表明,马传贫病毒在马体整合为前病毒之后比较稳定,这就为建立PCR鉴别诊断方法提供了依据。

    关键词:马传贫病毒;前病毒;gag ; gp90

    马传染性贫血病(equine infectious anemia, EIA)是马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)引起的一种马属动物的烈性传染病,曾给世界养马业带来巨大的经济损失。我国科研工作者早在20世纪70年代就研制出马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗,成为世界第一个成功的慢病毒疫苗,并用此疫苗成功地控制了我国马传贫的发生。有试验表明我国的马传贫弱毒疫苗对异源的美国、古巴和阿根廷等毒株也有很高的保护率。可见我国的马传贫驴细胞弱毒疫苗有希望进一步开发,为世界其它国家使用,然而各个国家现行诊断马传染性贫血病毒的方法主要是琼脂扩散试验和ELISA等血清学方法,患本病的马匹与接种过马传贫弱毒疫苗的马匹均可出现血清学阳性反应,不能将两者区分,阻碍了我国疫苗的进一步推广,急需建立PCR鉴别诊断的方法。由于马传贫病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一,病毒基因组在体内经常发生变异,而目前为止仅有对马传贫病毒感染马体内病毒RNA的env等几个基因进行过动态监测的文献报道,还没有对前病毒DNA基因的研究。本试验对阿根廷流行毒株感染马4个发热期外周血单核细胞前病毒gag和gp90基因进行了动态监测,以研究马传贫病毒感染马外周血单核细胞前病毒DNA基因的变异情况,为找到稳定的保守序列以设计鉴别诊断引物奠定基础。

    1　材料和方法

    1.1　材料

    大肠杆菌感受态细胞DH5α由本实验室保存、ExTaq酶、限制性内切酶HindⅢ和EcoRI、连接酶、克隆载体pMD18-T均购自大连宝生物工程公司。DNA提取试剂盒购自Qiagen公司。

    1.2　病毒和实验动物

    阿根廷流行毒株(Agen-EIAV)流行毒株由本实验室保存,健康马一匹购于哈尔滨本地,经琼脂扩散检测2次均为马传贫阴性。